סיפר עקידת יצחק מתאר את הניסיון העשירי והאחרון בו ניסה האל את אברהם. הסיפור התרחש לאחר כריתת הברית בין אברהם לאבימלך, מלך גרר, בה נשבעו שני הצדדים זה לזה. שבועה זו היא גם הסבר לשם שניתן למקום "באר שבע". אברהם נאמן לברית עם אבימלך. האל מצווה על אברהם להעלות לעולה את בנו יחידו אשר אהב, את יצחק. הצו מנוסח בצורה הדרגתית כמו הצו לאברהם לעזוב את ארצו ואת מולדתו בניסיון הראשון בבראשית יב. בדומה לצו האל בניסיון הראשון להגיע אל ארץ לא נודעת. מקום העקידה בתחילת הסיפור אינו ידוע. האל מצווה על אברהם ללכת אל ארץ המוריה ולעקוד את בנו על אחד ההרים אשר יאמר לו. ארץ המוריה מזוהה עם ירושלים, והר המוריה הוא הר עליו בנה שלמה את המקדש בספר דברי הימים, אך לפי מסורת אחרת הר המוריה הוא הר סיני.
אברהם השכים בבוקר, חבש את חמורו בעצמו, בקע עצי עולה ולקח את שני נעריו איתו ואת יצחק. ההליכה אל ארץ המוריה נמשכה שלושה ימים. אין הסיפור מתאר את רגשותיו או את מחשבותיו של אברהם ושל יצחק בזמן המסע. כאשר הגיעו אל ההר ביקש אברהם משני הנערים להישאר למרגלות ההר, והוא ויצחק עלו אל ההר. יצחק נושא את העצים להבערת האש, הרומזים על היותו הקורבן, מפני שיצחק עתיד להישרף גם הוא על המזבח: ואברהם אוחז בידו את האש ואת המאכלת הרומזים על היותו מקריב הקורבן. במהלך ההליכה אל המקום מתפתח דו-שיח קצר בין יצחק לאברהם. כאשר יצחק פונה אל אביו, אברהם עונה לו "הנני", כפי שענה אברהם לאל בתחילת הסיפור. המילה "הנני" מדגישה את נכונתו של אברהם כלפי האל וכעת כלפי יצחק בנו. יצחק שואל היכן השה לעולה, ואברהם עונה כי האל יבחר את השה. אברהם ויצחק מכונים "אבי" ו"בני" כדי להדגיש את הקרבה המשפחתית ואת הניסיון הקשה (אב מקריב את בנו). האב אברהם ויצחק הבן הולכים שניהם יחדיו גם במובן הגיאוגרפי וגם במובן הנפשי אל המקום בו תתקיים העקידה.
אברהם מתחיל בהכנות לקראת הקרבת בנו. רצף הפעולות של אברהם מדגיש את המהירות ואת הנכונות שפעל בהן: ויבוא, ויבן, ויערך, ויקד, וישם, וישלח, ויקח. אברהם עוקד את בנו ושם אותו על העצים, בלי להדליק אש במזבח. ידו של אברהם נשלחת אל המאכלת והוא מתכוון למלא אחר צו האל ללא היסוס. מלאך האל קרא לאברהם מן השמים "אל תשלח ידך אל הנער". להפתעתו אברהם רואה איל אחר (אחד) והוא מקריב את האיל במקום יצחק. המקום שהניסיון מתרחש בו הופך למקודש ונקרא בשם "הר ה'". מלאך האל קורא שוב אל אברהם מן השמים ומבטיח לו שוב כי צאצאיו יהיו רבים וגויי הארץ יתברכו בזרעו, אך הפעם להבטחות מתווספת שבועה של האל לקיים את הבטחותיו.